マルチプレックスPCR法と電気泳動

1)器具および試薬

サーマルサイクラー
アガロースゲル電気泳動装置
トランスイルミネーター
反応チューブ
QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit (100) (QIAGEN Cat. no. 206152)
Primer(表1を参照)
精製水(PCRグレード)
マイクロピペット及び滅菌チップ
アガロースゲル
エチジウムブロマイド(EtBr)

2)PCR反応

マルチプレックスPCR反応液(25μl反応系)
2x Multiplex PCR Master Mix (Qiagen)12.5μl
plcおよびcpeに対する各プライマー0.4μM最終濃度
becAおよびbecBに対する各プライマー0.2μM
DNAテンプレート(少なくとも10pg DNA/25μl)1μl
   全量が25μlとなるようにDWを加える


表1. 使用したプライマー
標的遺伝子プライマー名配列(5'-3')PCR産物の大きさ(bp)
cpeCPE Fggagatggttggatattagg233
 CPE Rggaccagcagttgtagata 
becA*1becA Fcaatggggcgaagaaaatta499
 becA Raaccatgatcaattaaaacctca 
becB*1becB Ftgcaaatgacccttacactga416
 becB Ragattggagcagagccagaa 
plc*2CPA Fgctaatgttactgccgttga324
 CPA Rcctctgatacatcgtgtaag 
*1 下痢症の主因はBECbであり、BECbの存在下でBECaは補助的にその液体貯留活性を高める1)。両成分とも下痢症の発生に関与することから、本法ではbecAおよびbecB両遺伝子を標的にした。
*2 全てのウェルシュ菌が保有するホスホリパーゼC(plc)遺伝子であり、コントロールとして使用した。



3)アガロースゲル電気泳動

2.5〜3.0%のアガロースゲルを作製し、100Vで35〜45分間、電気泳動する。
*2.5〜3.0%のアガロースゲルは突沸しやすいのでやけどに注意


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