本法の感度と特異性(文献3参照)

<感度について>

 cpe遺伝子保有株であるC. perfringens NCTC8239株およびbecAB遺伝子保有株であるC. perfringens OS1株を使用して本法の感度を調べた。

(方法)菌株それぞれをTGY培地 (3% Trypticase soy (BD)、2% D-glucose (Wako Pure Chemical Industries、Ltd.; Osaka, Japan)、1% yeast extract (BD)、and 0.1% L-cysteine (Wako)) で培養し、滅菌した同培地で10倍段階希釈した。培養液および希釈液それぞれを1ml分取し、遠心後、上清を除去して100μlの25mM NaOHで懸濁した。上述のアルカリ熱抽出法(1.2))により懸濁液からDNAを抽出し、PCRを実施した。

(結果)C. perfringens NCTC8239のcpe遺伝子は104 CFU/ml(図2A)、C. perfringens OS1株のbecAB遺伝子は103 CFU/ml(図2B)の菌液から検出された。本法は比較的良好な感度を有していた。




<特異性について>

 ウェルシュ菌株41株、ウェルシュ菌以外のクロストリジウム属菌21株およびその他の菌種145株からDNAを抽出し本法の特異性を確認した。

(方法)それぞれの菌株は血液寒天培地あるいはトリプトソーイ寒天培地を使用して37℃で十分な菌量が得られるまで培養した。嫌気性菌はガスパック法により嫌気条件下で培養した。上述のアルカリ熱抽出法(1.2))によりDNAを抽出し、PCRを実施した。

(結果)Pseudomonas aeruginosaから抽出したDNAをテンプレートとした場合、わずかに非特異的な増幅産物が確認されたが(図3の4〜7)、その他の菌株から抽出されたDNAを使用した場合は非特異的な増幅産物は確認されなかった。よって本法は非常に高い特異性を持つことが確認された。




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