試料からのDNA抽出

器具および試薬

 遠心分離装置(マイクロチューブおよび15ml 遠心チューブ用)、FastPrep Instrument (MP Biomedicals)、マイクロピペット及び滅菌チップ、滅菌先細スポイト、マイクロチューブ(1.5ml, 2.0ml)、15ml 遠心チューブ、FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)

患者便からのDNA抽出

 FastDNA SPIN Kit for Soil の取扱説明書に準じ、若干の変更を加え、以下の方法でDNAを抽出する。

 1Lysing Matrix E tube*に患者糞便検体**300 mgを秤量する。
 2Sodium Phosphate Buffer* 489 μl を加える。
 3転倒混和し、Lysing Matrix E tubeのビーズと試料液を混ぜる。
 410,000 rpmで数秒遠心する。
 5さらにSodium Phosphate Buffer 489 μl を加える。
 6MT Buffer* 122 μl を加える。
 7FastPrep Instrumentにより、速度6.0で40秒間破砕する。
 814,000 × gで5分間遠心する。
 92.0ml マイクロチューブに250 μl のPPS solution*を入れた後、遠心上清の全量を加えて、転倒混和する。
1014,000 × gで5分間遠心する。
1115ml 遠心チューブに再懸濁したBinding Matrix* 1ml を入れた後、遠心上清の全量を加える。
122分間転倒混和後、3分間静置する。
133,000 rpmで数秒遠心する。
14沈渣を崩さないよう注意しながら、滅菌先細スポイト等で上清をすべて捨てる。
15遠心沈渣に1ml のSEWS-M* (使用前にエタノールで希釈)を加え、転倒混和によって再懸濁する。
163分間静置後、マイクロピペットで上澄み液を捨てる。このとき、Binding Matrixを吸いとらないように注意する。
17Binding Matrix をピペッティングにより再懸濁し、全量(約600 μl)をSPIN Filter*に移した後、14,000 × gで1分間遠心する。
18Catch tube*を交換し、乾燥のために14,000 × gで2分間遠心する。
19Catch tubeを1.5ml マイクロチューブに交換し、室温で5分間放置する。
20100 μl のDES (DNase/Pyrogen-Free Water)*を加え、チップを使いFilter上でBinding Matrixと懸濁する。
2114,000 × gで1分間遠心する。
22溶出液をDNA抽出液として使用する。
  
  * 試薬および消耗品はすべてFastDNA SPIN Kit for Soilに含まれる。
  ** 冷凍保存ではなく、冷蔵保存された糞便検体を使用する。

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