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リアルタイムPCRによる検出

1)器具および試薬

 リアルタイムPCR装置(ABI PRISM7000または同等品)、反応チューブ、Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa)、Primer、Probe、精製水(PCRグレード)、マイクロピペット及び滅菌チップ

2)PCR反応

 表1に基づいて反応液を調製する。表1の1-6を混合し、各反応チューブに分注する。これにDNA抽出液、陽性コントロール、陰性コントロール(精製水)のいずれかを2μl 加える。軽く遠心後、リアルタイムPCR反応を行う。PCR反応条件は、(95℃, 30秒) ×1サイクルの後、(95℃, 5秒→60℃, 31秒)×50サイクルで実施する。


3)結果判定

 Threshold lineを儚n; 0.35に設定し、Ct値が41以下を示した検体をKudoa septempunctata 遺伝子陽性と判定する。

4)留意点

 本食中毒の発症機序はまだ解明されていないが、現在のところ、本寄生虫はヒトの消化管では増殖しないと考えられている。そのため、この試験法は大量に摂取されたKudoa septempunctata 胞子の遺伝子の一部を糞便中から検出しているものと推測される。

 2012年7月までに西日本で発生した生食用ヒラメに起因する30件の食中毒事例において、患者便90検体を解析したところ、喫食から糞便検体採取までの期間が3日未満の検体では陽性率が68.3%であるのに対し、3日以上の検体では25.9%であった。

 従って、喫食から糞便検体採取までの期間が検査結果に大きく影響すること、及び発症直後に採取した糞便であっても陰性となりうることに十分留意し、本試験法を食中毒調査に役立てていただくことが望ましい。

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