2. LAMP 法

 LAMP 法に用いる試薬はプライマーを除き、Loopamp DNA amplification kit (栄研化学)に含まれています。C. jejunii, C. coliおよびC. fetusの鑑別に用いるプライマーの配列は表1に示すとおりです。


2-1. 反応液の組成 (全量 25 μl)

テンプレートDNA 2 μl
Bst DNA Polymerase (8 unit) 1 μl
Reaction Mix 12.5 μl
プライマー(各100uM)  
   FIP 0.4 μl
   BIP 0.4 μl
   F3 0.05 μl
   B3 0.05 μl
   LF 0.2 μl
   LB 0.2 μl
滅菌精製水 8.2 μl

2-2. LAMP反応

 上記の反応液を専用のLAMP反応チューブ(栄研化学)内で混和し、Loopamp リアルタイム濁度計(LA-320、Teramecs)を用いて65 °C で60分間反応させます。必要に応じ、さらに 80 °C 2分間の条件で酵素反応を失活させます。


2-3. 結果の判定

 反応開始から60分以内に濁度0.1に達した検体を陽性と判定します。あわせて肉眼による判定を実施する場合、65 °C ・60分間の反応が終了した時点でLAMP反応チューブを目視し、チューブ内に明確な白濁が確認できていれば陽性と判定します。


表1 設計したLAMPプライマー
標的菌種プライマー名配列 (5' → 3')
C. jejuni a) CJ-FIPACAGCACCGCCACCTATAGT-AGAAGCTTTTTTAAACTAGGGC
CJ-BIPAGGCAGCAGAACTTACGCATT-GAGTTTGAAAAAACATTCTACCTCT
CJ-F3GCAAGACAATATTATTGATCGC
CJ-B3CTTTCACAGGCTGCACTT
CJ-LFCTAGCTGCTACTACAGAACCAC
CJ-LBCATCAAGCTTCACAAGGAAA
C. coli b) CC-FIPAAGAGATAAACACCATGATCCCAG-TCATGAATGAGCTTACTTTAGC
CC-BIPGCGGCAAAGACTTATGATAAAGC-TACCGCCATTCCTAAAACAAG
CJ-F3TGGGAGCGTTTTTGATCT
CJ-B3AATCAAACTCACCGCCAT
CJ-LFCCACTACAGCAAAGGTGATG
CJ-LBCCACGATAGCCTTTATGGA
C. fetus c) CF-FIPGGAAGAAGTTTTTGATATGCTGCAT-TCATGGGTTACTATAGCTCCT
CF-BIPAATGGAGAGAGAGTTCATGACGC-AGAGTTTCTA GTTTTTTCGCC
CF-F3GGA ACC GTA GTA TTA TTT AAA ATG G
CF-B3TAG CTA TGG CTG CTG GAT
CF-LFGTT ATA AGC ACC CAA ACA AG
CF-LBCGT AAG TCA CAT AGC TAC TG
 a) GenBank上のC. jejuni subsp. jejuniのoxidoreductase gene (AL111168、cj0414) からプライマーを設計。
 b) GenBank上のC. coliの gufA gene (AAFL01000003、CCO0367) からプライマーを設計。
 c) GenBank上のC. fetus subsp. fetusのcstA gene (AY158813) からプライマーを設計。

 注1:LAMP 法に用いるプライマーはメーカーや精製グレードによって増幅効率が異なることがあります。LAMP法で使用実績のあるメーカーのものを使用することをおすすめします。また、FIP・BIPプライマーはHPLCあるいは簡易カラムグレード、F3・B3・LF・LBプライマーは簡易カラムグレードを使用しています。
 注2:1本の反応チューブ内でC. jejuniiとC. coliをあわせて検出したい場合は、2セット分のプライマーを加え、精製水を1.3μl減らして反応液の全量を25 μlとしてください。

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