平成8年度

ニューバイオサイエンス研究事業報告書(概要)

 


 

  目 次

 

T. ウイルス性感染症の治療薬の開発

 

      1. エイズの発症予防及び治療薬の開発

 

      2. 動物レクチンを応用した治療薬の開発

 

U.結核菌の薬剤耐性に関与する遺伝子の研究

 

V.細菌性下痢症の遺伝子診断法に関する研究

 

W.下痢症ウイルスの遺伝子診断法の確立とウイルス流行の分子疫学的解明

 

X.食物成分の生理機能及び食物の安全性に関する研究

 

  平成9年度追加研究課題の紹介

Y.くすりの安全性に関する研究

 

Z.発表論文リスト

 


 

T. ウイルス性感染症の治療薬の開発

 

1. エイズの発症予防及び治療薬の開発

  天然物由来の物質として、すでに世界で用いられている薬用生薬約500種、微生物培養抽出物約2000種の計約2500種についてそれらの抗HIV活性を調べ、シコン、カゴソウ、カバアナタケ、レモンバーム、チョウセンアサガオなど数十種の抽出物が高い抗HIV活性を持つことを明らかにした。

  微生物培養抽出物から見い出されたポリエーテル・マクロライド系抗生物質であるボロマイシンの抗HIV作用を調べたところ、感染細胞から放出されるウイルスの感染性を低下させることが判明した。このことからボロマイシンはウイルスの形成成熟過程に作用して抗HIV活性を示すものと考えられた。

エジプト産生薬の抗HIVスクリーニングを行い、いくつかの有効成分を見い出しその作用メカニズムについて研究した。6種の植物から得られた8つの抽出物には、HIV-1の逆転写酵素およびプロテアーゼに対する阻害作用はなかったが、ウィルスと細胞の結合を阻害することおよびウイルスへ直接作用して感染性を低下させることが明らかになった。

超高圧処理によってHIVの感染性が失われることを見い出し、この技術が安全な血液製剤の製造法の一つとして応用できる可能性が示された。

  62種類のアシルアミノ酸およびアシルアルカノルアミンについて、MT-4細胞におけるそれらのN-ミリストイル化活性(N-ミリストイル化されたある蛋白質はHIVの複製に深く関係している)および抗HIV活性を測定した。その結果アシルアミノ酸はN-ミリストイル化活性を非競合性に阻害することが判明したが抗HIV活性は示さなかった。しかし、アシルアルカノルアミンはN-ミリストイル化活性を阻害しなかったもののMT-4細胞において抗HIV活性を示した。

 

2. 動物レクチンを応用した治療薬の開発

インフルエンザはインフルエンザウイルスによっておこる急性呼吸器疾患で、毎年流行を繰り返す。時に全世界的規模で流行し、その発生は爆発的であり、個人的にも、社会的にも被害は甚大である。インフルエンザの予防にはワクチン(不活化)の接種が必要であるが、最近わが国ではその接種率は低下する一方である。また、米国ではアマンタジンのようなインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤の開発も行われているが、その効果を疑問視するむきも多い。最近、血清中のレクチン(糖鎖を認識して結合する蛋白質、非特異的免疫活性を持つといわれている)の1つであるコングルチニンに、抗インフルエンザウイルス活性があることが明らかにされた。そこで、我々は、このレクチンおよびその他の哺乳類血清レクチン(マンナン結合蛋白、サーファクタント蛋白AおよびD)に注目し、インフルエンザに対する予防および治療薬としての可能性を調べた。

  サーファクタント蛋白Dはコラーゲン状と球状の2種類の領域からなるC型哺乳類レクチンの一つである。主に球状領域に糖との結合活性が担われている。このレクチンの球状領域をコードするcDNAを大腸菌-外来遺伝子発現ベクターに導入し、球状領域の組換え体の作製に成功した。この組換え体の糖鎖結合性等につ いて天然のレクチンと比較を行った結果、ほぼ同一の活性を有していることが明らかになった。次に大量生産した組換え体蛋白質を用いて、細菌凝集活性および 抗インフルエンザウイルス活性を有しているかどうか調べた。その結果、糖鎖認識領域だけの組換え体蛋白質では細菌凝集価が弱く、インフルエンザAウイルス の赤血球凝集を阻止することはできないことが判明した。このことはサーファクタント蛋白Dの活性発現にはコラーゲン状の領域が必要であることを示している。

  ウシマンナン結合蛋白に強い抗インフルエンザウイルス活性が期待できたので、その遺伝子のクローニングをウシ肝臓cDNAライブラリーより行った。塩基配 列の決定、ノーサンブロット解析等によりその性状を明らかにした。さらに塩基 配列をヒトのそれと比較することにより、遺伝子工学的により抗インフルエンザウイルス活性の高いヒトマンナン結合蛋白質を作製する計画である。

 

 

U.結核菌の薬剤耐性に関与する遺伝子の研究

  薬剤耐性結核菌は以前から数多く報告されてきており、治療面で大きな問題になっている。ところが、今日の薬剤耐性試験は直接法で2〜3週間、より精度の高い間接法に至っては6〜8週間の長い期間を要するという欠点がある。結核治療の現場においては、この欠点を補うためのより迅速な検査法の開発が切望されている。今回ストレプトマイシン(SM)耐性遺伝子について研究を行った。

  わが国で分離されたSM耐性結核菌のrpsL遺伝子およびrrs遺伝子の変異を調査し以下の成績を得た。

  1)PCR法でrpsL遺伝子を増幅後、制限酵素MboIIで切断し、電気泳動により変異を検出することを試みた結果、SM200μg/ml耐性菌の61.1%にアミノ酸置換が認められ、SM20μg/ml耐性菌およびSM感受性菌にはこの変異が認められなかった。このことからSM200μg/ml耐性菌の検出に本方法を利用することが可能であると考えられた。

  2)臨床分離株46株についてrpsL遺伝子の全領域およびrrs遺伝子の450番目から944番目の遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、SM耐性菌では36株中28株(77.8%)に変異が認められた。これに対して、SM感受性菌10株にはrpsL遺伝子およびrrs遺伝子に変異は認められなかった。これらの結果からrpsL遺伝子およびrrs遺伝子の450番目から944番目の遺伝子以外にもSM耐性に関与する遺伝子が存在すると推定されたが、この両遺伝子の変異を調べることにより77.8%のSM耐性菌を検出することができ、迅速検出法へ応用することの可 能性が高いことを示唆するものであった。

 

 

V.細菌性下痢症の遺伝子診断法に関する研究

  細菌性食中毒菌や細菌感染症による下痢症の確定診断は、専ら細菌学的な培養検査により原因菌を検出同定することによって行われている。そのためには原因菌に対応する個別の増菌培地、選択培地等を必要とし、さらに培養法も異なり多大な労力と時間を要する。また、真菌の日常検査は長時間にわたる培養と、顕微鏡による形態学的検査のみで行われているために、同定には細菌検査とは異なる熟練が必要となる。そこで原因菌を迅速、簡便、高感度に検出する目的でPCR法等による遺伝子診断導入の可能性を検討した。

  腸炎ビブリオの病原因子として、耐熱性溶血毒(TDH)およびTRH(TDH-related hemolysin)が知られている。最近ウレアーゼ産生性腸炎ビブリオの分離の報告が相次ぎ、病原性との関係が注目された。ウレアーゼ構造遺伝子の存在とTRH構造遺伝子の存在が完全に一致することを見いだし、ウレアーゼ産生性 腸炎ビブリオの病原性を証明した。さらに、腸炎ビブリオDNA上におけるtdh, trh およびure 遺伝子の位置の解析を行うため、臨床分離腸炎ビブリオ菌株(489株)より精製したDNAを制限酵素Hind・処理後、サザンハイブリダイゼーションを行い、tdh,trh 各遺伝子のRFLP (Restriction fragment length  

 polymorphism)について解析した。その結果、tdh はT〜X型の5タイプに、trhはT〜W型の4タイプに分類された。また、パルスフィールド電気泳動による解析から、tdh,trh およびure 遺伝子が染色体上で互いに近傍に位置していることが判明した。 

カンピロバクターを迅速に検出するために、23srRNAの一部を特異的に増幅するプライマーを作成し、カンピロバクター属標準株9菌種16株について、PCRを行った結果、特異性の高いプライマーを得ることができた。保存菌株109株について、DNAの抽出法についても検討した。また食中毒、散発下痢症から分離された サルモネラエンテリティーディス の疫学的解析を行うためにプラ スミッドプロファイルを実施し、国立感染症研究所で実施されたファージ型別の成績との比較検討を現在行っている。 

アスペルギルス 属のSection Flavi は、A. oryzae、A. sojae、A. tamarii、A.  flavus、A. parasiticus、A. nomius の6種に分類されている。これらを迅速、確実に同定するために、リボゾームRNA遺伝子を増幅するためのプライマー(general  primer) を数種類作成した。これらを用いて得られたPCR産物を、ホルムアミドを 添加したアクリルアミドゲル上で電気泳動し、SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism) 分析によって種を区別した。 この方法により真菌の68株中67株を A. flavus/A. oryzae、A. parasiticus/A. sojae、A. tamarii、A. nomius の4つのグループに分類することができた。

 

 

W.下痢症ウイルスの遺伝子診断法の確立とウイルス流行の分子疫学的解明

 ウイルス性下痢症には形態の特徴とともに遺伝的に異なる数種類のウイルスが関わっている。中でも小型球形ウイルス(SRSV:ノーウォーク形態類似ウイルス)とアストロウイルスは、乳幼児から成人までの広い年齢層が感染を受け、水系あるいは食品を介した胃腸炎の集団発生をしばしば引き起こすことから、防疫対策上常に問題を提起している。しかし、下痢症ウイルスの多くは培養が困難であることに加えて、下痢症患者の検査材料中には微量のウイルス抗原しか含まれていないなど診断は容易でない。このため昨年に引き続いて下痢症ウイルスの簡便で高感度なPCRによる遺伝子診断法の開発をすすめてきた。しかし最近アストロウイルスやSRSVには多様なセロタイプ(血清型)が存在することが知られるようになり、このためにウイルス診断には従来法に比べてさらに精緻な検査法の開発が必要である。そこで今年度は従来から進めてきた下痢症ウイルス全般のPCR法による遺伝子診断法の確立をすすめるとともに、新たに作製したプロ−ブ(合成DNA)によるウイルスのセロタイピング(血清型別)の技術開発をすすめ、併せて大阪府下で検出した下痢症ウイルスの塩基配列を解読して遺伝子の特徴からウイルスの流行の移り変りを調査した。

 1985年以降のおよそ10年間に我が国の8府県でSRSVを原因とする胃腸炎集団発生が見られた。59例の患者便材料について電顕法、RT-PCR法およびPCR増幅産物の塩基配列の分析をおこなった。PCRには代表株であるノーウォークウイルス株のポリメラーゼ領域のORF1とカプシッド領域のORF2からそれぞれ1対のプライマーを作製し試験に供した。電顕陽性サンプルは全てPCRでも同様に検出されたが、両プライマ−間には府下で検出したウイルスを含めて遺伝的相違が想定された。そこで個々のSRSVの塩基配列を分析した結果我が国におけるSRSVの遺伝的特徴は次のようであった。1)胃腸炎集団発生を引き起こすSRSVは遺伝的に多様である。2)本邦ではスノーマウンテンウイルスおよびOTH25/89(大阪分離株)と遺伝的に近縁なウイルスが優勢に流行している。3)サザンプトンウイルスに近縁なウイルスが見出された。

 

 

X.食物成分の生理機能及び食物の安全性に関する研究

a) アレルギー疾患は年々碓実に増え続けている(厚生省、保健福祉動向調査によると3人に1人が何らかのアレルギー症状をもっているといわれている)。この 原因の一つとして食生活の変化が考えられているが未だ明らかにされていない。 一方、日本人の食生活が近年急速に欧米化するにつれて、その栄養摂取状況は大 きく変化しており、とりわけ脂肪摂取は質、量ともに大きく変化している。また、この変化に呼応して乳幼児ではアトピー性皮膚炎や気管支喘息、食物アレルギーなどが深刻な問題となつている。そこでアレルギー疾患(喘息、花粉症、アト ピー性皮膚炎、食物アレルギーなど)の症状を緩和・抑制する成分を食物(食品)および生薬等から探索し、有望な有効成分の精製を行い、さらにその作用機構を調べた。

即時型アレルギー反応は、肥満細胞あるいは好塩基球の細胞膜のIgEレセプターと結合したIgE抗体と抗原との反応による細胞の脱顆粒反応によって化学伝達物質(顆粒内酵素β-Hexosaminidaseもその一つである)が放出される一連の反応で ある。日本薬局方外生薬規格に収載されている67種類の生薬の50%メタノー ル抽出液についてin vitro における抗アレルギー作用を含めた薬理活性作用を有 する物質の探索をラット好塩基球白血病(RBL-2H3)細胞を用いて実施した。

 その結果、漢方処方において消炎、鎮咳等に応用されるビワヨウの他8種類の生 薬アカメガシワ、ウヤク、エンメイソウ、オウヒ、カシュウ、モッカ、ボクソク、ヨウバイヒ末の抽出液はβ-Hexosaminidaseの遊離を50%以上抑制し、抗アレ ルギー作用を有することが明らかになった。

  また24種類の香辛料についてラット好塩基球白血病細胞(RBL-2H3)の脱顆粒反 応に及ぼす影響を調べた。その結果、β-Hexosaminidaseの遊離を抑制させるもの として、シナモン(けいひ)、クローブ(ちょうじ)、さんしょう、ガーリック、ベイリーブス(ローレル)、オレガノ、タイム、セージ、オールスパイスが見 いだされ、香辛料が従来有する作用以外に、食品の三次機能として新たに抗アレ ルギー作用を有する可能性が示唆された。

b) 食物の安全性確保は食品衛生行政を支える上で大切な業務と考えられる。そこで現在までに同定法の確立されていない物質、すなわち生物由来の毒素(例えば、毒化ホタテガイの中腸腺に存在するディノフィシストキシン、肝臓毒性の強い ペクテノトキシン類、ウロコオウギガニやヒロハオウギガニの食中毒原因物質で あるパリトキシン等)や天然食品添加物(例えば、色素、抗菌物質)等を免疫化 学的手法を用いて測定法の開発を進めている。

 

 

平成9年度追加研究課題の紹介

 

 

 

Y.くすりの安全性に関する研究

  臨床の場では、患者に対して複数の薬物が同時に投与されるケースがほとんどであるが、しばしばそれら薬物同士の相互作用に起因すると考えられる障害が観察されている。薬物相互作用の成因メカニズムにはいくつもの可能性が考えられるが、そのなかで薬物代謝酵素チトクロームP450(以下P450と略す)に関係するものが最も多く、しかも多様であることが指摘されている。ケトコナゾールとテルフェナジンの同時投与によるテルフェナジン毒性の増加はその一例で、これはケトコナゾールが肝臓のP450酵素の一種類であるP4503A4酵素を強く阻害する結果、テルフェナジン代謝が進まず、死亡例を含む重篤な障害がみられたのである。本研究では、くすりの安全性確保のための研究の一貫として、P450酵素を中心とする薬物相互作用の成因の機構の解明と、予防のための基礎的研究をおこない、実際の臨床の場での薬物相互作用による薬害の防止を目的として研究を行う。

 

 

Z.発表論文リスト

I.ウイルス性感染症の治療薬の開発

  1. エイズ発症予防及び治療薬の開発

 

1) Screening of Egyptian folk medicinal plant extracts for anti-human immunodeficiency virus type-1(HIV-1) activity

Journal of Traditional Medicine,13(1), 59-65, 1996

  Takuya Kawahata, Toru Otake, Haruyo Mori, Motoko Morimoto, Noboru   Ueba, Ines Tomoco Kusumoto, Sahar Elmekkawy, Masao Hattori and   Tsuneo Namba

2) Boromycin, an anti-HIV antibiotic

Biosci Biotech Biochem, 60(6), 1036-1037, 1996

Jun Kohno, Takuya Kawahata, Toru Otake, Motoko Morimoto, Haruyo Mori, Noboru Ueba, Maki Nishio, Akio Kinumaki, Saburo Komatsubara and Keisuke Kawashima

3) Inactivation of HIV by high hydrostatic pressure

Transfusion, 36, 475-476 1996

Tatsuyoshi Nakagami, Hiroshi Ohno, Tamotsu Shigehisa, Toru Otake, Haruyo Mori, Takuya Kawahata, Motoko Morimoto and Noboru Ueba

4) Inhibition of Octapeptide N-myristoylation by acyl amino acids and acyl alkanolamines

J. Enzyme Inhibition, 12, 27-36, 1997

Masaki Tabuchi, Hiroyuki Okamoto, Toshiyuki Furutani, Masayuki Azuma, Hiroshi Ooshima, Toru Otake, Takuya Kawahata and Jyoji Kato

 

2. 動物レクチンを応用した治療薬の開発

1) Structure of truncated human surfactant protein D is less effective in agglutinating bacteria than the native structure and fails to inhibit haemagglutination by influenza A virus.

Biochem. J.,323, 393-399 (1997)

Souji Eda1, Yasuhiko Suzuki1, Takao Kawai, Tetsuo Kase, Yousuke Fujinaga, Katsuki Otani, Takashi Sakamoto, Takashi Kurimura and Nobutaka Wakamiya

2) Cloning and characterization of a cDNA encoding bovine mannan-binding protein

Gene 86, 161-165 (1997)

  Takao Kawai1, Yasuhiko Suzuki, Souji Eda, Katsuki Otani, Tetsuo Kase, Yousuke Fujinaga, Takashi Sakamoto, Takashi Kurimura and Nobutaka Wakamiya

3) コレクチンによるウイルス感染防御

臨床免疫、29 (4)、508-513 (1997)

  若宮伸隆、鈴木定彦

 

U. 結核菌の薬剤耐性に関与する遺伝子の研究

 

1) Characterization of the rpsL and rrs genes of streptomycin-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis in Japan

Journal of Applied Microbiology, 83, 1997

C. Katsukawa, A. Tamaru, Y. Miyata, C. Abe, M. Makino and Y. Suzuki

 

V. 細菌性下痢症の遺伝子診断法に関する研究

1) Restriction fragment length polymorphism of the tdh and trh genes in clinical

Vibrio parahaemolyticus strains

J. Clin. Microbiol., 34: 1293−1295. 1996

Suthienkul, O., Iida,T., Park, K., Ishibashi, M., Supavej, S., Yamamoto, K. and Honda, T.

2) Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacers To Differentiate Species of Aspergillus Section Flavi.

Appl. Environ. Microbiol., 62:2947-2952. 1996

Kumeda, Y., and T. Asao

 

W. 下痢症ウイルスの遺伝子診断法の確立とウイルス流行の分子疫学的解明

1) Reverse transcription-polymerase chain reaction detection and sequence analysis of small round-structured viruses in Japan

Archives of Virology, 12(Suppl), 271-276 (1996)

Kenji Yamazaki, Mitsuaki Oseto, Yoshiyuki Seto, Etsuko Utagawa, Tatsuo Kimoto, Yoshiichi Minekawa, Sakae Inoue, Shudo Yamazaki, Yoshinobu Okuno, Isao Oishi

2) 日本の感染性胃腸炎・、感染性腸炎研究会(入交昭一郎、齋藤 誠、中谷

林太郎、松原義雄 監修、菜根出版)291〜304、1997

  大石 功、山崎謙治、奥野良信

 

V. 食物成分の生理機能及び食物の安全性に関する研究

1) ラット好塩基球白血病(RBL-2H3)細胞からのβ-Hexosaminidase遊離におよぼ す局方外生薬50%メタノール抽出液の影響

Natural Medicines, 50(5), 344-348 (1996)

  片岡正博、高垣 裕

2) ラット好塩基球白血病細胞からのβ-ヘキソサミニダーゼ遊離に及ぼす香辛料の

影響

  食品衛生学雑誌、38 (1)、7-11

  田中之雄、小西良昌、高垣 裕

 

平成9年度追加研究課題の紹介

 

Y. くすりの安全性に関する研究

 

1) Role of Cytochrome b5 in the Oxidation of Testosterone and Nifedipine by Recombinant Cytochrome P450 3A4 and by Human Liver Microsomes

Arch. Biochem. Biophys., 325, 174-182, 1996

Hiroshi Yamazaki, Masami Nakano, Yoshio Imai, Yune-Fang Ueng, F.Peter Guengerich, and Tsutomu Shimada

2) In Vivo and In Vitro Characterization of CYP2E1 Activity in Japanease and Caucasians

J. Pharmacol. Exp. Ther., 279, 4-11, 1996

Richard B.Kim, Hiroshi Yamazaki, Kan Chiba, Diaruid O'shea, Mayumi Mimura, F.Peter Guengerich, Takashi Ishizaki, Tutomu Shimada and Grant R. Wilkinson

3) Activation and Inactivation of Carcinogenic Dihaloalkanes and Other compounds by Glutathione S-Transferase 5-5 in Salmonella typhimurium tester strain NM5004

Chem. Res. Toxicol., 9, 333-340, 1996

Tsutomu Shimada, Hiroshi Yamazaki, Yoshimitsu Oda, Akira Hiratsuka, Tadashi Watabe, and F.Peter Guengerich

4) Lack of Electron Transfer from Cytochrome b5 in Stimulation of Catalytic Activities of Cytochrome P450 3A4

J. Biol. Chem., 271, 27438-27444, 1996

Hiroshi Yamazaki, William W. Johnson, Yune-Fang Ueng, Tsutomu Shimada, and F.Peter Guengerich

5) Effects of Freezing, Thawing, and Storage of Human Liver Samples on the Microsomal Contents and Activities of Cytochrome P450 Enzymes

Drug Metab. Dispos., 25, 168-174, 1997

Hiroshi Yamazaki, Kiyoshi Inoue, connie G. Turvy, F. Peter Guengerich, and Tutomu Shimada

  



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