平成9年度 ニューバイオサイエンス研究事業

- 研究成果の概要 -

. ウイルス性感染症の治療薬の開発
. 遺伝子工学的手法を用いた薬剤耐性結核菌の迅速鑑別法の開発
。. 細菌性下痢症の遺伝子診断法に関する研究
「. 下痢症ウイルスの遺伝子診断法の確立とウイルス流行の分子疫学的解明
」. 食物成分の生理機能及び食物の安全性に関する研究
、. くすりの安全性に関する研究
■発表論文リスト

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. ウイルス性感染症の治療薬の開発

1) エイズの発症予防及び治療薬の開発

 ワクチン開発が困難を極めているエイズ (HIV感染症)はアジドチミジン(AZT) やジダノシン(ddI)の出現により、治療薬による克服の可能性が示されている。 さらにこれら核酸アナログ系逆転写酵素阻害剤および、あらたに開発されたプロテアーゼ阻害剤のうち2〜3種の薬剤を併用することにより、顕著な治療効果が示されることが次第に明らかになりつつある。このことから複数の作用メカニズムを持つ薬剤の併用投与が有効である可能性が示された。そこで、新しい作用メカニズムを持つ抗エイズ薬の開発が待たれているのが現状である。当グループは化学合成物質および天然物由来の物質を対象に、エイズウイルス(HIV)の増殖を抑制する活性を持つ抗エイズ薬の探索および開発を1988年以来行ってきた。

 安全な血液製剤を確保するために、超高圧処理によるHIVの無毒化について検討を続けており、HIV-1のHTLV-IIIB株が4000気圧以上で死滅することをすでに報告した。今年度はこの技術によるHIVの不活化のメカニズム、および他のHIV株に対する超高圧処理の効果について検討した。

 2種の臨床分離株は実験室株であるHTLV-IIIBより高水圧処理に対して抵抗性を示し、それらのウイルス株を不活化するためには5000気圧以上の圧力を要した。また、高水圧によりHIV-1の逆転写酵素活性が低下することが観察され、この度合いはそれぞれの株における感染性の低下の程度と一致した。さらに電子顕微鏡による観察にて、ウイルスの構造に変化が見られた。以上のことからHIVの不活化は逆転写酵素活性の低下又はHIV粒子の構造が障害を受けることに因るものであることが示唆された。

 新たな抗HIV剤の開発のために、天然型ヌクレオシドの鏡像体であるL型ヌクレオシドを含むDNA 断片を構造解析し、 その二本鎖条件でのL型ヌクレオシド残基の構造に基づき、新規な炭素環ピリミジンヌクレオシドアナログをデザインし、その合成を行った。しかしながら、これらの誘導体には明らかな抗HIV-1活性は認められなかった。

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2) 動物レクチンを応用した治療薬の開発

 インフルエンザはインフルエンザウイルスによっておこる急性呼吸器疾患で、毎年流行を繰り返す。時に全世界的規模で流行し、その発生は爆発的であり、個人的にも、社会的にも被害は甚大である。インフルエンザの予防にはワクチン(不活化)の接種が必要である。しかし、その効果に対して否定的な見方もあり、最近のわが国では、その接種率は低下する一方である。また、米国ではアマンタジンのようなインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤の開発も行われているが、その効果を疑問視するむきも多い。最近、血清中のレクチン(糖鎖を認識して結合する蛋白質)の1つであるコングルチニンに、抗インフルエンザウイルス活性があることが明らかにされた。そこで、我々は、このレクチンおよびその他の哺乳類血清レクチン(マンナン結合蛋白、サーファクタント蛋白AおよびD)に注目し、インフルエンザに対する予防および治療薬としての可能性を追求 している。

 今年度は、ウシマンナン結合蛋白およびウサギマンナン結合蛋白の遺伝子(cDNA)をクローニングすることに成功した。また、その全塩基配列の決定も行った。さらに哺乳動物細胞におけるリコンビナントコングルチニンの発現にも成功し、得られたリコンビナントコングルチニンが天然型と同様な性状を持つことも証明した。大腸菌中でのマンナン結合蛋白の発現に成功し、抗インフルエンザウイルス活性について検討した。

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. 遺伝子工学的手法を用いた薬剤耐性結核菌の迅速鑑別法の開発

  薬剤耐性結核菌は以前から数多く報告されてきており、治療面で大きな問題に なっている。ところが、今日の薬剤耐性試験は直接法で2〜3週間、より精度の高い間接法に至っては6〜8週間の長い期間を要するという欠点がある。結核治療の現場においては、この欠点を補うためのより迅速な検査法の開発が切望されている。今年度はカナマイシン耐性遺伝子について研究を行った。

 セカンドライン抗結核剤のひとつであるカナマイシンは蛋白質合成過程に見られるペプチジルtRNA生成に影響を及すことが知られている。大腸菌では修飾酵素をコードする遺伝子の存在あるいは16SリボゾームRNA(rrs)遺伝子上の点突然変異による耐性獲得機構が知られている。最近スメグマ菌における耐性獲得がrrs遺伝子上の点突然変異によることが明らかとなった。そこで本研究では臨床分離結核菌のrrs遺伝子上の変異とカナマイシン耐性の相関性について検討した。

 塩基配列を決定し、比較を行った結果、カナマイシン耐性菌株のうち29株においてこの領域にスメグマ菌で見い出されたものと同様の変異が見い出された。またこれらの変異はPCR−RFLPにより容易に検出できることも確認した。残り14株のカナマイシン耐性菌についてはrrs遺伝子の他の領域あるいはrrs以外の遺伝子の研究が必要と考えられる。

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。. 細菌性下痢症の遺伝子診断法に関する研究

 細菌性食中毒菌や細菌感染症による下痢症の確定診断は、専ら細菌学的な培養検査により原因菌を検出同定することによって行われている。そのためには原因菌に対応する個別の増菌培地、選択培地等を必要とし、さらに培養法も異なり多大な労力と時間を要する。また、糸状菌の日常検査は長時間にわたる培養と、顕微鏡による形態学的検査のみで行われているために、同定には細菌検査とは異なる熟練が必要となる。そこで原因菌を迅速、簡便、高感度に検出する目的でPCR法等による遺伝子診断導入の可能性を検討した。

 腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus )のヒトに対する起病因子として、耐熱性溶血毒(Thermostable direct hemolysin:TDH )およびTDHとアミノ酸レベルで高い相同性を有しTDHに類似した活性を示すTRH(TDH-rerated hemolysin )が知られている。また近年、ウレアーゼ産生性腸炎ビブリオの下痢症患者からの分離報告が相次いでおり、その起病性が注目されている。我々は既に、腸炎ビブリオ菌株においてウレアーゼ構造遺伝子とTRH構造遺伝子が同時に存在すること、さらに両遺伝子の腸炎ビブリオゲノムDNA上での局在様式を調べた結果、trh とure 遺伝子間の距離は10 kb 以内と極めて近接して存在し、tdh遺伝子も近傍に位置することをつきとめた。このことから、病原性腸炎ビブリオのゲノムDNAでは病原因子の集合体が形成されていると考えられる。

 一方、旅行者下痢症患者より分離した腸炎ビブリオに、1996年以降特定の血清型菌が極めて高頻度に検出されることを見いだし、当該菌型が東南アジアから極東アジア地域にかけて爆発的に流行している事実をつきとめた。そこで、インド、バングラデシュおよび関西空港検疫所でそれぞれ分離された当該菌について、流行の原因を究明することを目的としてその遺伝子解析を行った。その結果、これらの菌株は遺伝子学的に同一のクローンであり、それ以前に分離された同一血清型菌とは異なっていた。さらにtdh遺伝子は保有するがtrh遺伝子を持たずウレアーゼ陰性であることが判明した。この新しいクローン菌の病原毒素の産生レベルは従来の病原株と同じレベルであることから、流行をもたらす新たな感染因子の存在も考えられる。

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「. 下痢症ウイルスの遺伝子診断法の確立とウイルス流行の分子疫学的解明  

 ウイルス性下痢症には形態の特徴とともに遺伝的に異なる数種類のウイルスが関わっている。中でも小型球形ウイルス(SRSV:ノーウォーク形態類似ウイルス)とアストロウイルスは、乳幼児から成人までの広い年齢層が感染を受け、水系あるいは食品を介した胃腸炎の集団発生をしばしば引き起こすことから、防疫対策上常に問題を提起している。しかし、下痢症ウイルスの多くは培養が困難であることに加えて、下痢症患者の検査材料中には微量のウイルス抗原しか含まれていないなど診断は容易でない。このため昨年に引き続いて下痢症ウイルスの簡便で高感度なPCRによる遺伝子診断法の開発をすすめてきた。しかし最近アストロウイルスやSRSVには多様なセロタイプ(血清型)が存在することが知られるようになり、このためにウイルス診断には従来法に比べてさらに精緻な検査法の開発が必要である。

 そこで今年度は従来から進めてきた下痢症ウイルス全般のPCR法による遺伝子診断法の確立をすすめるとともに、SRSVに関しては、大阪府内で市販されていた生食用牡蛎20検体についてRNA抽出を行い、RT-PCR法によりSRSVの検出を行った。このうち4検体 (20%) からSRSVが検出された。分離されたSRSVについてサザンブロットハイブリダイゼーションによりGenotypeの決定をしたところ、3株は2型であり、1株は1型と2型の混合であった。

 アストロウイルスに関しては、大阪で流行した交野株(K23)のORF2(カプシッド翻訳領域)の全塩基配列の決定をおこなった。K23のORF2 の塩基数は2337塩基、アミノ酸は778残基でありオックスフォード株6型(Oxf 6)と同数であった。Oxf 6とのホモロジーは94.7%(核酸) および 95.3%(アミノ酸) であった。またロタウイルスに関してはこれまで日本国内では検出されていないB群ヒトロタウイルスの検出法の開発を進め、B群ロタウイルスの疫学が行えるようにした。

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」. 食物成分の生理機能及び食物の安全性に関する研究

 a) アレルギー疾患は年々確実に増え続けている(厚生省、保健福祉動向調査によると3人に1人が何らかのアレルギー症状をもっているといわれている)。なかでも乳幼児ではアトピー性皮膚炎や気管支喘息、食物アレルギーなどが深刻な問題となつている。そこでアレルギー疾患(喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーなど)の症状を緩和・抑制する成分を食物(食品)および生薬等から探索し、有望な有効成分の精製を行い、さらにその作用機構を調べた。

 抗アレルギー作用を有する物質の検索方法としては、大きく分けて2通り考えられる。その一つは当プロジェクトが従来から行ってきたin vitro におけるアレルギー反応観察系を用いて行う方法であり、もう一つは動物を使用する方法である。前者は迅速、簡便な方法で多くの試料を扱える利点があるが、実際に動物に投与して効果があるかどうかを確認することはできない。後者の方法は実際の効果を確認できるが検索に時間と手間がかかり一度に多くの試料を処理できない欠点がある。今回、抗DNP-IgE抗体を用いた受動免疫による測定法を開発した。この方法を食品に応用したところ、シソ、キャベツ、イチョウ葉、ウーロン茶、緑茶に抑制効果が見られた。

 小柴胡湯は経口投与3時間後に抗原DNP-As刺激による肥満細胞からのヒスタミン遊離を有意に抑制し、その効果は投与量依存的で1.0g/Kg以上で有意であった。その効果は既存の経口抗アレルギー薬よりやや弱いものであったが、これは、小柴胡湯に抗アレルギー作用が有ることを示唆するものである。小柴胡湯は細胞質内カルシウム濃度の上昇に影響を与えなかったことから、そのヒスタミン遊離抑制の作用点は、蛋白質リン酸化反応の過程に存在する可能性が示唆された。

  b) 食物の安全性の確保(食品中の有害物質の有無の確認)は食品衛生行政を支える上で大切な業務である。今年度は生物由来の毒素であるテトロドトキシン(フグ毒)に対するマウスモノクロナール抗体を作製し、この抗体を用いてテトロドトキシンを2-100 ng/mLの範囲で定量的に測定する系を確立した。また測定に要した時間はおよそ30分間であった。マウスを用いるバイオアッセイ法では測定不可能な濃度においてもこの方法では定量が可能であった。

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、. くすりの安全性に関する研究

 臨床の場では、患者に対して複数の薬物が同時に投与されるケースがほとんどであるが、しばしばそれら薬物同士の相互作用に起因すると考えられる障害が観察されている。薬物相互作用の成因メカニズムにはいくつもの可能性が考えられるが、そのなかで薬物代謝酵素チトクロームP450(以下P450あるいはCYPと略す)に関係するものが最も多く、しかも多様であることが指摘されている。ケトコナゾールとテルフェナジンの同時投与によるテルフェナジン毒性の増加はその一例で、これはケトコナゾールが肝臓のP450酵素の一種類であるCYP3A4酵素を強く阻害する結果、テルフェナジン代謝が進まず、死亡例を含む重篤な例がみられたのである。本研究では、くすりの安全性確保のための研究の一貫として、P450酵素を中心とする薬物相互作用の成因の機構の解明と、予防のための基礎的研究をおこない、実際の臨床の場での薬物相互作用による薬害の防止を目的としている。

 P450酵素による薬物相互作用の成因と予防の基礎に関する研究を、P450の酵素蛋白の側からの研究と、P450遺伝子を基礎とした分子生物学的研究の両面から実験を進めた。薬物代謝反応に関係するヒトのP450酵素は、少なくとも10種類以上の分子種からなっている。そこで、P450酵素を中心とする薬物相互作用の理解には、特定の薬物があるP450酵素の代謝反応を阻害し、結果的に併用薬の代謝に影響を与え、薬効・毒性に変化をもたらす例が多い。ヒトのP450酵素分子種の代謝反応に阻害的に影響を与える薬物の同定と、その阻害型式について調べ、さらに、これら阻害薬の存在下、他の薬物の代謝反応がどのように影響されるかを整理し、試験管内での薬物相互作用の理解の基礎的知見を得るための実験系を考えた。また、P450分子種の生体内存在量には個人差のあることが知られており、結果的に薬物相互作用を含む薬剤感受性に個人個人で違いのあることも指摘されている。このP450酵素の個人差についても、蛋白質ならびにDNA遺伝子の両面からの検討を行った。

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■発表論文リスト

. ウイルス性感染症の治療薬の開発

1. エイズ発症予防及び治療薬の開発

1) Design and racemic synthesis of conformationally restricted carbocyclic pyrimidine nucleoside anlogs based on the structure of the L-nucleoside redidue in heterochiralDNAChem. Pharm.Bull. 46, 458-461(1998) Hidehito Urata, Hidetaka Miyagoshi, Hitoshi Kakuya, Hideki Tokumoto, Takuya Kawahata, Toru Otake and Masao Akagi

2) Effects of High Hydrostatic-Pressure Treatment on HIV InfectivityHigh Pressure Research in the Bioscience and Biotechnology,K.Heremans(Ed.) Leuven University Press, Leuven, Belgium(1977) T.Otake, H.Mori, T.Kawagata, Y.Izumoto, I.Oishi, T.Shigehisa and H.Ohono

 

2. 動物レクチンを応用した治療薬の開発

1) Characterization of recombinant bovine conglutinin expressed in a mammalian cellBiochem Biophys. Res. Commun. 238, 856-860(1997) Yasuhiko Suzuki , Souji Eda1, Takao Kawai, Katsuki Ohtani, Tetsuo Kase1, Takashi Sakamoto and Nobutaka Wakamiya

2) Molecular and biological characterization of rabbit mannan-binding protein (MBP)Glycobiology 8, 237-244(1998)Takao Kawai, Yasuhiko Suzuki, Souji Eda, Katsuki Ohtani, Tetsuo Kase, Yousuke Fujinaga, Takashi Sakamoto, Takashi Kurimura and Nobutaka Wakamiya

 

. 遺伝子工学的手法を用いた薬剤耐性結核菌の迅速鑑別法の開発

1) Detection of kanamycin resistant Mycobacterium tuberculosis by searching mutations on the 16S ribosomal RNA gene.J. Clin. Microbiol. 36:1220-1225 (1998) Yasuhiko Suzuki, Chihiro Katsukawa, Aki Tamaru, Chiyoji Abe, Masanao Makino, Yasuo Mizuguchi and Hatsumi Taniguchi

 

。. 細菌性下痢症の遺伝子診断法に関する研究

1) Restriction fragment length polymorphism of the tdh and trh genes in clinical Vibrio parahaemolyticus strainsJ. Clin. Microbiol., 34: 1293−1295(1996) Suthienkul, O., Iida,T., Park, K., Ishibashi, M., Supavej, S., Yamamoto, K. and Honda, T.

2) Evidence for genetic linkage between the ure and trh genes in Vibrio parahaemolyticusJournal of Medical Microbiology 46, 639−645(1997) Iida T., Suthienkul O., Park K.S., Tang G.Q., Yamamoto R.K., Ishibashi M., Yamamoto K., and Honda T.

3) Emergence of a unique O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus in Calcutta, India, and isolation of strains from the same clonal group from southeast asian travelers arriving in JapanJ. Clin. Microbiol. 35, 3150−3155(1997) Okuda J., Ishibashi M., Hayakawa E., Nishino T., Takeda Y., Mukhopadhyay A.K., Garg S., Bhattacharya S.K., Nair G.B., and Nishibuchi M.

 

「. 下痢症ウイルスの遺伝子診断法の確立とウイルス流行の分子疫学的解明

1) ウイルス性胃腸炎薬局、49, 6 (1998)  印刷中山崎謙治、奥野良信

 

」. 食物成分の生理機能及び食物の安全性に関する研究

1) Rapid and highly sensitive enzyme immunoassay for quantitative determination of tetrodotoxinJpn.J.Med.Sci.Biol., 50 , 133-150, (1997)  Kawatsu K., Hamano Y., Yoda T., Terano Y., and Shibata T.

2) Ex vivo effect of a herbal medicine Sho-saiko-to on histamine release from rat mast cellsEuropean Archives of Oto-Rhino-Laryngology ( in Press) T. Matsumoto and T. Shibata

3) Development of the methods for detection of anti allergic components in foods (2)Japanease Journal of Food Chemistry 4 (1), 17-20(1997) Tobimatsu Y., Kataoka H., Hirasawa R., Inoue T., Kaihara A., Kobayashi Y., Sawa N.,Semma M., Ito Y., and Takagaki Y.

 

、. くすりの安全性に関する研究

1) Expression of cytochrome P450 3A7 in Escherichia coli: Effects of 5' modification andcatalytic characterization of recombinant enzyme expressed in bicistronic format with NADPH-cytochrome P450 reductaseArch. Biochem. Biophys. 346, 81-90, (1997) Gillam E. M. J. , Wunsch R. M. , Ueng Y. -F. , Shimada T. , Reilly P. E. B. , Kamataki T. , and Guengerich F. P.

2) Relationship between CYP2C9 and 2C19 genotypes and tolbutamide methyl Caucasian populationsPharmacogenetics 7, 103-113, (1997) Inoue K. ,Yamazaki H. , Imiya K., Akasaka S. , Guengerich F. P., and Shimada T.  

3) Aflatoxin B1 8,9-epoxide hydrolysis in the presence of rat and human epoxide hydrolaseChem. Res. Toxicol. 10, 672-676 (1997) Johnson W. W. , Yamazaki H. , Shimada T. , Ueng Y. -F., and Guengerich F. P.

4) N-Oxidation of irsoglandine by the CYP2C subfamily in the rat, dog, monkey and manXenobiotica 27, 995-1003(1997) Nakamura A. , Hirota T., Morino A., Shimada T. , and Uematsu T.

5) Inhibition of human cytochrome P450-catalyzed oxidations of xenobiotics and procarcinogens by synthetic organoselenium compoundsCancer Res. 57, 4757-4764, (1997) Shimada T., El-Bayoumy K. ,Upadhyaya P. , Sutter T. R. , Guengerich F. P. , and Yamazaki H.

6) Oxidation of xenobiotics by recombinant human cytochrome P450 1B1Drug Metab. Dispos. 25, 617-622(1997 ) Shimada T. , Gillam E. M. J., Sutter T. R. , Strickland P. T., Guengerich F. P., and Yamazaki H.

7) Cytochrome P450-dependent xenobiotic-oxidizing activities of liver microsomes in various animal species including rats, guinea pigs, dogs, monkeys, and humansArch. Toxicol. 71, 401-408(1997) Shimada T. , Mimura M., Inoue K., Nakamura S., Oda H., Ohmori S., and Yamazaki H.

8) Reconstitution of recombinant cytochrome P450 2C10 (2C9) and comparison with cytochrome P450 3A4 and other forms: Effects of cytochrome P450-P450 and cytochrome P450-b5 interactionsArch. Biochem. Biophys. 342, 329-337(1997) Yamazaki H., Gillam E. M. J., Dong M. -S. , Johnson W. W. , Guengerich F. P. , and Shimada T.

9) Different contributions of cytochrome P450 2C19 and 3A4 in the oxidation of omeprazole by human liver microsomes: Effects of contents of these two forms in individual human samplesJ. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 434-442(1997) Yamazaki H. , Inoue K., Shaw P. M. , Checovich W. J. , Guengerich, F. P. and Shimada T.

10) Progesterone and testosterone hydroxylation by cytochromes P450 2C19, 2C9, and 3A4 in human liver microsomes  Yamazaki H. and Shimada T.

11) Human liver cytochrome P450 enzymes involved in the 7-hydroxylation of R- and S-warfarin enantiomersBiochem. Pharmacol. 54, 1195-1203, (1997) Yamazaki H. and Shimada T.

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